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            GTC|593-84-0|法與試劑盒法在提取分枝桿菌RNA中的對比

            2017-03-29 來源:亞科官網
            2017-3-29
                    結核病是全世界十大死因之一,據WHO報道,2015年,1040萬人患有結核病,180萬人因該病死亡。結核病由結核分枝桿菌引起,在分子水平上研究其致病與耐藥機制迫在眉睫,對其RNA的提取是分子生物學研究的重要常規實驗。有研究人員將異硫氰酸胍(GTC)裂解液和RNA提取試劑盒提取分枝桿菌RNA進行了對比[1],本文將對其進行總結。
            異硫氰酸胍法
                    在無菌離心管內加入500μL去污液溶液(120mM醋酸鈉,9.6%Tween-80,pH4),500μL水飽和酚,100μL氯仿/異戊醇(24:1)及幾顆直徑2~3mm的無菌玻璃珠,放置于冰上預冷。
                    取一定量的卡介苗(BCG)培養物放在無菌離心管中,加入1.5mL GTC溶液,10.5μL β-巰基乙醇,渦流混勻,5,000g,4℃離心30min,再以13,000g,4℃離心60s,使菌體沉淀。在沉淀中加入1mL 0.5%Tween-80,于13,000g,4℃離心30s,清洗一遍。棄去上清之后加入200μL H2O,混勻,將懸浮液轉移至先前預冷的離心管中,用TissueLyser-24多樣品組織研磨機震蕩破碎細胞。15,000g,4℃離心10min。取上層水層約500μL加入等量氯仿/異戊醇(24:1)震蕩45s,13,000g,4℃離心10min。輕取水層,加入等量異丙醇溶液,混勻后置于−70℃至少30min。15,000g,4℃離心15min,棄去異丙醇溶液,蒸發剩余溶劑,加入40μL無菌水溶解RNA,−20℃保存。
            RNA提取試劑盒法
                    取一定量的BCG培養物放置于無菌離心管中,加入1mLPBS,100μL溶菌酶/TE buffer(pH 8.0),渦流混合30s。30℃溫育10min。加入350μL buffer BRK,7μL β-巰基乙醇,30mg玻璃粉,劇烈渦流振蕩5min,13,000g,4℃離心5min。取上清液400μL加入等量70%乙醇,混合。將混合液上樣硅膠柱上,13,000g,4℃離心60s。用RNA Wash buffer 1及RNA Wash buffer 2分別洗滌2次,干燥硅膠柱。40μL DEPC水洗脫硅膠柱上的RNA,−20℃保存。
                    從不同干重的BCG中分別用異硫氰酸胍法和RNA提取試劑盒法提取總RNA。1~5mg、6~10mg、20~30mg的BCG中用異硫氰酸胍法分別提取了平均213μg、234μg、148μg的RNA,而用RNA提取試劑盒法提取到得RNA幾乎為零。
                    隨著商業化的發展,國內外許多生物試劑公司研發出了許多RNA提取試劑盒,這些市面上常見的試劑盒主要采用的裂解液為Trizol試劑以及溶菌酶,研究結果表明異硫氰酸胍法用于提取結核分枝桿菌RNA具有明顯優勢。另外,就成本而言,異硫氰酸胍法明顯低于Trizol試劑盒,特別是在需要大批量抽提RNA時,成本優勢更為明顯。因此,在需要大批量抽提分枝桿菌RNA時,異硫氰酸胍法是一個更好的選擇。
            參考文獻
            [1] 俞埡美, 王姍姍, 褚麗花, 等. 適用于結核分枝桿菌RNA 抽提的實驗方法學研究. 2016, 21, 609-612.

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